Разработка ингибиторов никующей эндонуклеазы BspD6I на основе синтетических фрагментов ДНК

Абросимова Л.А. , Мигур А.Ю. , Кубарева Е.А. , Венде В. , Железная Л.А. , Орецкая Т.С.

2015 / Номер 2 [ Прикладная биохимия и биотехнология ]

Никующие эндонуклеазы (НЭ), узнающие в двутяжевой ДНК специфические последовательности и вносящие разрыв в определенное положение только одной из цепей ДНК, нашли широкое примене- ние в молекулярной биологии и генетической инженерии. НЭ представляют собой перспективные ферменты в качестве молекулярных инструментов для расщепления ДНК вблизи дефектного ге- на с целью его последующего «исправления». Отсутствие неспецифического гидролиза ДНК яв- ляется ключевым требованием этого метода. Актуальной задачей является направленное регу- лирование активности НЭ, что предотвратит появление неконтролируемых разрывов в ДНК, приводящих к нежелательным последствиям для клетки. На примере НЭ BspD6I разработан под- ход, позволяющий «выключать» и «включать» фермент в заданный момент времени с помощью внешнего сигнала (изменение температуры) за счет использования термочувствительных ана- логов субстрата. Сконструированы 13- и 15-звенные немодифи-цированные синтетические ДНК- дуплексы, которые блокируют активность фермента при 20 °С. Повышение температуры вызы- вает диссоциацию дуплексов-ингибиторов и приводит к инициации ферментативного гидролиза протяженной ДНК при ~ 40–50 °С. Предлагаемый подход может быть использован для оптимиза- ции реакции изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи, а также для модулирования активности химерных нуклеаз, применяемых в генной терапии.

Ключевые слова:

регулирование активности ферментов; никующие эндонуклеазы; термо- чувствительные аналоги субстрата.

Файлы:

• Реферат (скачать | просмотреть) - скачано 9 раз
• Статья (скачать | просмотреть) - скачано 47 раз