Гетерологическая экспрессия и характеристика нового мутантного ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoganaphthophila
Гришин Д.В. , Жданов Д.Д. , Гладилина Ю.А. , Покровская М.В. , Александрова С.С. , Соколов Н.Н.
2019 / Том 9: номер 2 [ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ ]
П редставлены данные по клонированию, гетерологической экспрессии и характеристике рекомбинантных гомологов ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila (TnaDBP, TnaDBP-mut). Предварительно нуклеотидная последовательность исходного термостабильного белка TnaDBP подвергалась кодоновой оптимизации в соответствии с особенностями строения и работы системы нуклеинового обмена клеток мезофильной бактерии Escherichia coli, использовавшейся в дальнейшем в качестве лабораторного штамма-продуцента. Сконструированы экспрессионные векторные конструкции, обеспечивающие эффективную продукцию белков TnaDBP и TnaDBP-mut в клетках E.coli. Подобраны оптимальные условия культивирования трансформированных штаммов для биосинтеза растворимой формы целевого белкового продукта. Проведено а эробное культивирование микроорганизмов в контролируемых условиях. Были изучены особенности кинетики роста трансформированных клеток E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut]. При этом продемонстрировано, что время выхода роста культуры E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut], продуцирующей мутантный ДНК-связывающий белок на стационарную фазу при культивировании в жидкой питательной среде, составляет до 10 ч после внесения индуктора. Предложена малостадийная схема очистки полученных белков с использованием процедуры термолизиса. Проведена предварительная оценка растворимости и термостабильности белка по его первичной аминокислотной последовательности. Рассмотрены потенциальные области применения рекомбинантных вариантов термостабильного ДНК-связывающего белка TnaDBP. По результатам работы стало очевидно, что благодаря уникальным физико-химическим свойствам подобные белки представляют большой интерес с биотехнологической точки зрения и могут найти применение в различных отраслях промышленности в качестве источников незаменимых L-аминокислот для культур эукариотических клеток в качестве основы для энтерального питания сельскохозяйственных животных, а также в качестве необходимой компонентной базы при разработке невирусных векторных систем и белков-носителей в области биомедицины и фундаментальной науки.
Ключевые слова:
рекомбинантный белок,термостабильность,ДНК-связывающий белок,штамм-продуцент,экспрессия,биотехнология,recombinant protein,thermal stability,DNA binding protein,producing strain,expression,biotechnology
Библиографический список:
- Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2008. 1392 p.
- Perales C., Cava F., Meijer W.J.J., Berenguer J. Enhancement of DNA, cDNA synthesis and fidelity at high temperatures by a dimeric single-stranded DNA-binding protein // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31. P. 6473-6480. DOI: 10.1093/nar/gkg865
- Olszewski M., Grot A., Wojciechowski M., Nowak M., Mickiewicz M., Kur J. Characterization of exceptionally thermostable single-stranded DNA-binding proteins from Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana // BMC Microbiology. 2010. Vol. 10. P. 260. DOI: 10.1186/1471-2180-10-260.
- Cernooka E., Rumnieks J., Tars K., Kazaks A. Structural Basis for DNA Recognition of a Single-stranded DNA-binding Protein from Enterobacter Phage Enc34 // Scientific Reports. 2017. Vol. 7. Issue 1. P. 15529. DOI: 10.1038/s41598-017-15774-y
- Kur J., Olszewski M., Długołecka A., Filipkowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) - sources and applications in molecular biology // Acta Biochimica Polonica. 2005. Vol. 52. Issue 3. P. 569-574.
- Гришин Д.В., Покровская М.В., Подобед О.В., Гладилина Ю.А., Покровский В.С., Александрова С.С., Соколов Н.Н. Прогнозирование термостабильности белков по их первичной структуре: современное состояние и факторы развития // Биомедицинская химия. 2017. Т. 63. N 2. C. 124-131.
- Sterner R., Liebl W. Thermophilic adaptation of proteins // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2001, vol. 36, issue 1, pp. 39-106. DOI: 10.1080/20014091074174.
- Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B // FEBS Letters. 1994. Vol. 355. Issue 1. P. 106-108.
- Grishin D.V., Gudov V.P., Sergienko O.V., Lunin V.G., Kharchenko P.N. Creation of a protein vector construct including an SSBTne DNA-binding domain and VirD2 nuclear localization signal // Russian Agricultural Sciences. 2008. Vol. 34. Issue 5. P. 329-331. DOI: 10.3103/S1068367408050145.
- Cuadros C., Lopez-Hernandez F.J., Dominguez A.L, McClelland M., Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses // Infection and Immunity. 2004. Vol. 72. Issue 5. P. 2810-2816. DOI: 10.1128/IAI.72.5.2810-2816.2004. DOI: 10.1128/IAI.72.5.2810-2816.2004
- Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M., Pozzan T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells // Current Biology. 1995. Vol. 5. Issue 6. P. 635-642. https://doi.org/10.1016/S0960-9822(95)00128-X
- Grishin D.V., Gladilina Y.A., Aleksandrova S.S., Pokrovskaya M.V., Podobed O.V., Pokrovskii V.S., Zhdanov D.D., Sokolov N.N. Creation of thermostable polypeptide cassettes for amino acid balancing in farm animal rations // Applied Biochemistry and Microbiology. 2017. Vol. 53. Issue 6. P. 688-698. DOI: 10.1134/S0003683817060072
- Гришин Д.В., Подобед О.В., Гладилина Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С., Покровский В.С., Соколов Н.Н. Биоактивные белки и пептиды: современное состояние и новые тенденции практического применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве // Вопросы питания. 2017. Т. 86. N 3. C. 19-31.
- Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Research. 1997. Vol. 25. Issue 17. P. 3389-3402. DOI: 10.1093/nar/25.17.3389
- Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic Acids Research. 1997. Vol. 25. Issue 24. P. 4876-4882.
- Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic Acids Researh. 2007. Vol. 35. P. 43-46. DOI: 10.1093/nar/gkm234
- Ku T.H., Lu P.Y., Chan C.H., Wang T.S., Lai S.Z., Lyu P.C., Hsiao N.W. Predicting melting temperature directly from protein sequences // Computation Biology and Chemistry. 2009. Vol. 33. Issue 6. P. 445-450. DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2009.10.002
- Diaz A., Tomba E., Lennarson R., Richard R., Bagajewicz M., Harrison R.G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression // Biotechnology and Bioengineering. 2010. Vol. 105. Issue 2. P. 374-383. htts://doi.org/10.1002/bit.22537
- Drury L. Transformation of bacteria by electroporation // Methods in Molecular Biology. 1996. Vol. 58. P. 249-256. Gibson D.G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments // Methods in Enzymology. 2011. Vol. 498. P. 349-361. DOI: 10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2
- Yadav P., Yadav A., Garg V., Datta T.K., Goswami S.L., De S. A novel method of plasmid isolation using laundry detergent // Indian Journal of Experimental Biology. 2011. Vol. 49. Issue 7. P. 558-560.
- Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. Issue 1-2. P. 248-254. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3
- Laemmli B.U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. No. 5259. P. 680-685. DOI: 10.1038/227680a0
- Yang C., Xu Y., Jia R., Li P., Zhang L., Wang M., Zhu D., Chen S., Liu M., Yin Z., Cheng A. Prokaryotic expression of a codon-optimized capsid gene from duck circovirus and its application to an indirect ELISA // Journal of Virological methods. 2017. Vol. 247. P. 1-5. DOI: 10.1016/j.jviromet.2017.05.003
- Tanaka M., Tokuoka M., Gomi K. Effects of codon optimization on the mRNA levels of heterologous genes in filamentous fungi // Applied Microbiology and Biotechnology. 2014. Vol. 98. No. 9. P. 3859-3867. DOI: 10.1007/s00253-014-5609-7
- Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression // Trends in Biotechnolody. 2004. Vol. 22. Issue 7. P. 346-353. DOI: 10.1016/j.tibtech.2004.04.006
- Murashima K., Kosugi A., Doi R.H. Solubilization of cellulosomal cellulases by fusion with cellulose-binding domain of noncellulosomal cellulase engd from Clostridium cellulovorans // Proteins. 2003. Vol. 50. Issue 4. P. 620-628. DOI: 10.1002/prot.10298
- Yuan H., Yang X., Hua Z.C. Optimization of expression of an annexin V-hirudin chimeric protein in Escherichia coli // Microbiological Research. 2004. Vol. 159. Issue 2. P. 147-156. DOI: 10.1016/j.micres.2004.02.002
- Costa S., Almeida A., Castro A., Domingues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system // Frontiers in Microbiology. 2014. Vol. 5. 20 p. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00063.
Файлы: